O acervo do Museu da Imagem e do Som do Rio de Janeiro, hoje com aproximadamente 1.300 metros lineares de documentos, é constituído de 22 coleções particulares que reúnem documentos nos mais variados suportes. A maioria delas chegou ao MIS por meio de doação, e outras foram adquiridas no momento de sua fundação.
Com exceção das coleções de dois grandes fotógrafos do início do século (Augusto Malta e Guilherme Santos) e de algumas personalidades vinculadas ao cinema, como é o caso do cinegrafista e diretor Jurandir Noronha, grande parte do acervo é proveniente de coleções particulares de pessoas e instituições relacionadas a atividades musicais — compositores, cantores, maestros, radialistas, críticos musicais e produtores de discos —, o que revela a preponderância do som sobre a imagem, processo compreensível no caso do Rio de Janeiro. Integra o acervo do MIS a coleção do radialista Almirante; dos músicos Abel Ferreira e Jacob do Bandolim; do pesquisador de música Sérgio Cabral; e de vários intérpretes da música brasileira, como as irmãs Linda e Dircinha Batista, Nara Leão, Elizeth Cardoso, Odete Amaral, Zezé Gonzaga e, recentemente, de Paulinho Tapajós. Além das já mencionadas, o MIS possui um acervo raro: a coleção da Rádio Nacional com documentos, dos quais se destacam partituras, scripts e discos dos principais programas executados na rádio.
Além das coleções doadas ou adquiridas, o MIS produz, desde 1966, sua própria coleção: Depoimentos para Posteridade, constituída a partir da gravação, em áudio e vídeo, de depoimentos prestados por personalidades vinculadas aos diversos setores da cultura. São quase mil depoimentos que perfazem aproximadamente quatro mil horas de gravação, disponíveis para consulta nas duas sedes do Museu.
A partir da década de 1980, o acervo passou a ser tratado por suporte, dando origem aos diversos setores técnicos que compõem a Diretoria Técnico Operacional do Museu. Assim, fotografias, cartazes, gravuras, etc. são tratados pelo Setor de Iconografia do MIS; os discos, pela Discoteca; os filmes e os vídeos estão sob a responsabilidade da Filmoteca/Videoteca, sendo que os filmes estão guardados fisicamente na Cinemateca do MAM; as fitas de áudio são tratadas pelo Setor Fitas de Áudio; os recortes de jornais, pela Hemeroteca; os documentos textuais, pelo Setor de Textuais.
Além dos setores, o MIS possui uma pequena reserva técnica, onde estão guardados os objetos tridimensionais das diferentes coleções, tais como: saxofone de Abel Ferreira, piano de Ernesto Nazaré, indumentária de Elizeth Cardoso, de Jacob do Bandolim, entre outros. O acervo bibliográfico — cerca de 9.000 títulos entre livros, catálogos, revistas e teses — aguarda tratamento. Apesar da organização setorial, a lógica interna dessas coleções foi preservada e pode ser recuperada na busca ao banco de dados, possibilitando ao pesquisador perceber a unicidade e a organicidade desses conjuntos documentais.